Bài 6. Thực hành tách chiết DNA

a) Mục đích

• Tách chiết DNA từ tế bào để phục vụ nghiên cứu và ứng dụng công nghệ gene.

b) Nguyên tắc

• Phá vỡ màng tế bào và nhân tế bào để giải phóng DNA.
• Loại bỏ protein và các tạp chất khác.
• Tinh chế và cô đặc DNA.

a) Bước 1: Chuẩn bị mẫu

• Lấy mẫu mô hoặc tế bào (ví dụ: bạch cầu, mô thực vật, vi khuẩn).
• Nghiền nhỏ mẫu (nếu cần) để phá vỡ thành tế bào.

b) Bước 2: Ly giải tế bào

• Sử dụng dung dịch ly giải (lysis buffer) chứa:
• SDS hoặc Triton X-100: phá vỡ màng.
• NaCl: duy trì tính tan của DNA.
• EDTA: ức chế enzyme phân giải DNA (DNase).
• Đun nóng nhẹ hoặc vortex để ly giải hoàn toàn.

c) Bước 3: Loại bỏ protein

• Thêm proteinase K để phân giải protein.
• Thêm dung dịch phenol-chloroform để loại bỏ protein (hòa tan trong phenol).
• Ly tâm để tách pha.

d) Bước 4: Kết tủa DNA

• Thêm isopropanol hoặc ethanol lạnh vào dịch nổi chứa DNA.
• DNA sẽ kết tủa thành sợi trắng.
• Ly tâm thu lấy kết tủa DNA.

e) Bước 5: Rửa và hòa tan DNA

• Rửa kết tủa bằng ethanol 70% để loại bỏ tạp chất.
• Để khô ethanol, hòa tan DNA trong nước hoặc TE buffer.

a) Dung dịch ly giải (Lysis buffer)

• SDS (Sodium dodecyl sulfate): chất hoạt động bề mặt, phá vỡ màng tế bào.
• NaCl: duy trì nồng độ ion, giữ DNA hòa tan.
• EDTA: chelat hóa Mg²⁺ và Ca²+, ức chế DNase.
• Tris-HCl: duy trì pH ổn định.

b) Enzyme

• Proteinase K: phân giải protein trong mẫu.
• RNase: phân giải RNA (nếu cần DNA tinh khiết).

c) Dung môi hữu cơ

• Phenol: phân giải và loại bỏ protein.
• Chloroform: loại bỏ phenol còn sót.
• Isopropanol/Ethanol: kết tủa DNA.

a) Phương pháp điện di trên gel agarose

• DNA di chuyển trong gel theo kích thước.
• Dùng thuốc nhuộm EB hoặc SYBR Green để quan sát.
• DNA nguyên vẹn xuất hiện dưới dạng một band rõ.

b) Đo quang phổ

• Đo OD260 để xác định nồng độ DNA.
• Tỷ lệ OD260/OD280 ≈ 1.8 cho thấy DNA tinh khiết.
• Tỷ lệ < 1.8 cho thấy còn protein, > 1.8 cho thấy còn RNA.